浅谈基因工程在番茄抗旱方面的作用论文

浅谈基因工程在番茄抗旱方面的作用论文

　　摘要：番茄抗旱性是由许多微效基因座和数百个影响干旱形态和生理反应的基因控制的, 阐明番茄抗旱的分子机制、开发分子标记辅助选择将有助于加速培育具有抗旱性的番茄新品种。本文概述了番茄抗旱分子机制的研究进展、番茄在干旱条件下的形态特征变化和抗旱育种, 重点阐述了番茄抗旱性基因工程改良方面的研究进展, 为进一步应用现代生物技术进行植物抗旱性基因工程改良和分子标记辅助选择育种提供方法和思路。

　　关键词：番茄; 抗旱; 育种; 基因工程; 综述;

　　中国人口众多, 农业生产所用的淡水资源十分匮乏, 人均仅有2 200 m3, 是全球人均淡水资源最贫乏的国家之一 (王海波, 2011) 。干旱缺水在众多非生物胁迫中是最具破坏性的, 同时也是限制作物产量和品质的一个重要影响因素 (Tuberosa&Salvi, 2006) 。其中生殖生长期受干旱影响最大, 在生殖阶段干旱胁迫可以直接导致作物的产量损失大于50% (Boyer, 1982) 。

　　干旱胁迫通常伴随着热胁迫或其他胁迫, 植物使用多种策略来响应干旱胁迫并且通过多种信号级联和渗透调节等形态和生理改变以适应干旱。Levitt (1981) 认为, 植物适应干旱的机理可分为避旱、御旱和耐旱, 并且将御旱性和耐旱性统称为抗旱性。避旱即植物在干旱来临之前加速发芽, 缩短生命周期以避免干旱胁迫;御旱即植物在干旱初期, 胁迫尚不严重时, 通过改变地上部和根系性状以减少水分损失, 维持较高的水势, 以应对干旱胁迫;耐旱即植物演变出一系列的缓解机制如积累渗透保护剂, 防止细胞内水分散失;产生胁迫感应信号, 抗氧化剂和活性氧 (ROS) 清除剂;降低光合酶活性以降低光合作用等生理生化反应, 在严重干旱胁迫下维持细胞结构的稳定性。尽管已经有一些策略能够提高植物的抗旱性, 但由于抗旱性状的生理和遗传复杂性, 在改善抗旱性或开发抗旱品种方面进展缓慢。

　　番茄 (Solanum lycopersicum L.) 是全世界栽培最广泛的蔬菜作物之一, 全球番茄产量达到1.6亿t, 其中超过30%产自中国 (联合国粮农组织,同时, 番茄也是植物科学研究的重要模式植物之一。番茄原产地在南美洲热带地区, 属于需水量较多的一种蔬菜作物, 环境胁迫中干旱胁迫是限制番茄产量和品质的主要制约因素 (柏成寿和陆帼一, 1991) 。因此选育抗旱性强的番茄品种是重要的育种目标。目前, 主要通过常规育种、生物技术或两者结合的方法改良植物的抗旱性。近年来, 诸多学者围绕着番茄抗旱性做了大量颇具价值的研究工作, 为番茄抗旱性的改良奠定了基础。

　　1 干旱对番茄形态特征的影响

　　1.1 干旱对番茄根系的影响

　　根系发育直接受环境因素的影响, 拥有一个健壮的根系对于提高作物的抗旱性非常重要。最具代表性的智利番茄 (S.chilense) 生长在世界上最干旱的地区, 其发达的根系能够促进植株吸收深层土壤的水分 (Chetelat et al., 2009) 。Champoux等 (1995) 认为, 水稻根系厚度、根系表面积、每分蘖根干质量、最大根深度和根/茎比均与田间抗旱性呈正相关。杨再强等 (2016) 发现, 在干旱胁迫时土壤中番茄的浅层根系会减少, 根系深扎、根表面积增加, 然而随着干旱胁迫的加剧, 植物正常的生长机制遭到破坏, 导致根长、根表面积和根尖数等降低, 根系的正常生长受到显着抑制。

　　1.2 干旱对番茄叶片的影响

　　水分胁迫或其他逆境信号会诱导多种离子进出保卫细胞, 造成保卫细胞内成分发生变化, 从而导致保卫细胞形态改变, 造成气孔关闭、卷叶、植物的蒸腾速率降低, 与植物抗旱性有关的叶片性状包括叶片形状 (卷叶) 、角质层、气孔密度、气孔孔径、叶片渗透调节等。

　　Kadioglua等 (2012) 发现, 水稻、玉米、小麦和高粱等作物的叶片适度卷曲可以改变植物叶片结构, 增强光合作用, 通过减少水分蒸发流失延迟衰老并增加冠层光透射。当干旱胁迫严重时, 通过诱导并加速植物叶片的衰老来减少绿叶面积, 从而减少蒸腾和水分的消耗 (安玉艳和梁宗锁, 2012) 。但是在作物生产中, 干旱胁迫引起的叶片衰老, 导致干旱解除后作物冠层面积的'减少和光合同化能力的降低, 进而引起整株早衰并最终导致作物产量和品质的下降 (Rivero et al., 2007) 。

　　气孔在控制植物蒸腾失水、降低叶片表面的高温、吸收CO2进行光合作用以及促进植物生长方面扮演着极其重要的角色 (Damour et al., 2010) 。番茄气孔大部分集中于叶片下表皮, 叶片下表皮的气孔密度远远大于上表皮;随着土壤水分亏缺强度的增加, 叶片上表皮气孔密度逐渐增大, 而下表皮气孔密度呈现先减小后增大的趋势 (刘朝霞, 2016) 。潘那利番茄 (S.pennellii) 叶片表皮具有较多气孔, 可吸收和利用空气中的水分, 并且叶片上有丰富的蜡质, 可以降低干旱情况下的水分丧失, 对干旱胁迫具有明显的耐受性 (Chetelat et al., 2009) 。

　　2 番茄抗旱性育种的研究进展

　　种质资源是育种的基础。由于番茄是一种严格的自花授粉植物, 经过长期的驯化和选育, 番茄的遗传背景逐渐变窄 (Rick, 1986) 。因此, 通过广泛的育种策略丰富番茄的种质资源对番茄育种极其重要。研究人员正努力通过常规育种技术、分子辅助育种和转基因技术等育种方法获得抗旱性强的番茄品种。

　　2.1 番茄抗旱性基因工程改良研究进展

　　转基因技术能够打破物种界限、克服生殖障碍, 把重要的抗旱基因整合到品种中, 能够快速、有效地改良作物的抗旱性。植物为了适应干旱胁迫, 进化出多个调节不同干旱响应基因的互作信号传递链, 这些干旱响应基因用于产生在干旱条件下起作用以增强植物抗性的蛋白质, 如转录因子 (TF) 、酶、分子伴侣和其他功能性蛋白等。目前, 已经有很多基因通过超量或抑制表达来检测基因在植物抗旱中的作用, 并且取得了很大的进展, 这些在抗旱中有功能的基因不但可以直接改良植物的抗旱性, 也可以开发标记, 为分子标记辅助选择 (MAS) 育种奠定基础。

　　2.1.1 抗旱相关转录因子

　　植物碱性亮氨酸拉链蛋白 (b ZIP) 、干旱响应元件结合蛋白 (DREB) 、NAC和锌指 (Zinc finger) 蛋白等编码多种TF家族成员, 能够提高植物抗旱性 (Yamaguchi-Shinozaki&Shinozaki, 2006;Ariel et al., 2007;Ciftci-Yilmaz&Mittler, 2008;Fang et al., 2008) , 这些TF基因的异位表达或抑制可能激活多种胁迫耐旱机制。

　　植物的b ZIP转录因子能通过参与脱落酸 (ABA) 信号转导途径, 调控植物对干旱胁迫的反应。Orellana等 (2010) 研究Sl AREB1在番茄中的功能作用时, 将Sl AREB1基因在番茄中超量表达, 转基因番茄植株显着提高了对干旱和高盐胁迫的耐受性, 同时大规模基因表达分析显示Sl AREB1能够上调与高盐、干旱和氧化应激相关基因的表达。

　　一些DREB/CBF基因在ABA独立的干旱响应过程中起重要作用, 并且通过分离和鉴定该家族的很多成员发现, 它们能够改良植物的抗旱性。首先在拟南芥中发现DREB (包括两个亚类:DREB1和DREB2) 在干旱胁迫中起作用 (Liu et al., 1998) 。将拟南芥的At CBF1转录因子在rd29A启动子的控制下, 在番茄中异源表达, 能够显着提高转基因番茄植株对干旱胁迫的耐受性, 并且植株正常生长 (Singh et al., 2011) 。然而Li等 (2012) 研究发现, 当SIDREB基因在番茄中超量表达时, 由于合成赤霉素的关键基因下调表达, 导致转基因番茄叶片扩大和节间伸长受到限制, 从而造成矮小的表型, 由此提高了转基因番茄的抗旱性。

　　NAC由NAM、ATAF和CUC组成, 属于植物特有的TF家族, 番茄中共有102条NAC蛋白, 这个家族的部分基因参与植株对病原体、病毒感染和环境刺激的反应 (Souer et al., 1996;Nuruzzaman et al., 2013) 。Liu等 (2014) 研究发现, 将NAC转录因子Sl SRN1沉默能够增加转基因番茄对生物胁迫的敏感性, 如因灰葡萄孢菌、丁香假单胞菌而感染疾病, 但会提高转基因番茄对氧化、高盐、干旱胁迫的耐受性。Sl NAC4调控干旱和高盐的相关基因表达, 在番茄抗旱过程中起着很重要的作用 (Zhu et al., 2014) 。由此, NAC蛋白可以作为功能基因资源, 用于改善植物对生物和非生物胁迫的耐受性 (Nakashima et al., 2012;Puranik et al., 2012) 。

　　其他转录因子, 如乙烯响应因子 (ERF) 不仅能够促进植物种子萌发、果实成熟、器官脱落、病原体反应和衰老, 还能够参与植物胁迫反应 (Narayana, 1991) ;并且其他研究还证明, ERF的TF家族参与植物胁迫反应 (Lorenzo et al., 2003) 。Klay等 (2014) 研究发现, 属于番茄ERF家族的转录因子Sl-ERF.B.3基因在干旱以及盐分胁迫下被下调表达, 但有趣的是低温、高温胁迫会诱导其表达。超量表达1个番茄的WRKY转录因子Sl WRKY39, 显着提高了番茄的抗旱能力 (Sun et al., 2015) 。番茄的1个SR/CAMTA转录因子Sl SR1和Sl SR3L负向调控番茄的抗病能力, 但是正向调控番茄的抗旱性 (Li et al., 2014a) 。

　　2.1.2 氧化调控相关基因

　　活性氧 (ROS) 会导致脂质过氧化、蛋白质和核酸的变性等, 可通过抑制ROS积累以减轻干旱胁迫, ROS的清除是由一系列酶和非酶抗氧化剂以及有机化合物完成的 (Gill&Tuteja, 2010) 。

　　过氧化氢酶 (CAT) 是一种抗氧化酶, 属于ROS清除剂, 负责将H2O2分解成水和氧气, 以维持植株体内活性氧的平衡。将源自大肠杆菌的过氧化氢酶 (cat E) 基因引入番茄的叶绿体后, 转基因株系对过氧化氢具有更高的亲和性, 并且转基因番茄中cat E基因过表达不仅能够提高因冷胁迫或干旱胁迫而引起的氧化损伤的耐受性, 还能够提高由除草剂百草枯引起的氧化应激的耐受性 (Mohamed et al., 2003) 。

　　在高等植物中, 超氧化物歧化酶 (SOD) 作为抗氧化酶和ROS的清除剂, 负责催化超氧自由基产生的O2和H2O2。在植物细胞中根据酶的活性位点上具有不同的金属 (Fe2+、Mn2+和Cu2+) , 以及它们在亚细胞定位中不同的位置 (细胞质、线粒体、过氧化物酶体和叶绿体) , 将其分为几种SOD异构体 (Wang et al., 2007;Aydin et al., 2014) 。如Mn SOD基因在番茄植株中的过表达能提高对高盐和干旱胁迫的抗性, 且降低了电解质的渗透率, 这意味着Mn SOD能够降低活性氧对转基因番茄的损伤 (Wang et al., 2007) 。

　　葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 (G6PDH) 在戊糖磷酸途径中首先氧化葡萄糖-6-磷酸 (G6P) , 是该反应的限速酶, 并且能够产生大量的NADPH。G6PDH活性增强能够为抗氧化系统提供NADPH, 以去除过量的ROS, 保护细胞膜的稳定性 (Santo et al., 2012) 。G6PDH启动子中具有不同的ABA响应元件, 其表达部分是由于ABA的诱导 (Cardi et al., 2011) 。G6PDH在干旱条件下与ABA合成相关的NCED, ABA信号转导因子PP2C, 参与脯氨酸合成的P5CS, 参与ROS清除的抗坏血酸过氧化物酶 (APX) 等其他干旱相关基因均在番茄的应激反应中呈现显着上调和活性增强, 并且在干旱条件下呈现持续增长的状态 (Landi et al., 2016) 。综上所述, 干旱诱导ABA合成和信号传导, 特异性激活ABA应答基因, G6PDH则被特异地诱导, 以此满足清除系统 (例如APX) 增加引起的增加还原剂的需求, 从而调节和稳定ROS的增量, 进而提高了植物的抗旱性 (Landi et al., 2016) 。

　　2.1.3 信号传导相关基因

　　当细胞壁首先感知非生物胁迫后会激活涉及不同胁迫基因的信号转导 (Oliveira et al., 2014) 。转录后蛋白修饰如蛋白磷酸化/去磷酸化, 蛋白降解/修饰和第二信使的感应如Ca2+, 它们在胁迫信号传导和调节中发挥重要作用。一些TF和干旱响应蛋白需要通过被磷酸化/去磷酸化或修饰等翻译后调节以获得活性, 例如编码丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK) 、编码CIPK蛋白激酶的基因、编码钙依赖蛋白激酶 (CDPK或CPK) 和编码蔗糖非酵解型蛋白激酶钙依赖蛋白激酶 (Sn RK) 等的基因都在干旱胁迫信号传导和调节途径中起作用。MAPK在耐受胁迫相关的信号网络中起关键作用 (Huang et al., 2012) 。将植物暴露于各种非生物胁迫条件下时, MAPK参与ABA的调节过程 (Hirayama&Shinozaki, 2007) , Li等 (2013) 使用VIGS方法发现Sp MPK1、Sp MPK2和Sp MPK3基因通过影响ABA-H2O2途径影响H2O2的产生和气孔的运动来增强番茄的耐旱性。超表达Sl MPK7的转基因番茄会积累较少的ROS、更多的脯氨酸和可溶性糖以及诱导胁迫响应基因表达, 提高转基因番茄对非生物胁迫的耐受性 (Yu et al., 2016) 。CIPK和CDPK是两种类型的Ca2+-敏感蛋白激酶, 据报道Md SOS2L1 (源自苹果的CIPK激酶) 能够增加番茄和苹果中抗氧化代谢物的水平 (Hu et al., 2016) 。Sn RK是广泛存在于植物中的一类Ser/Thr类蛋白激酶, 在植物抗逆生理过程中具有重要的作用, 例如在番茄中抑制表达Sl Sn RK2.1、Sl Sn RK2.2显着提高了转基因番茄对渗透胁迫的耐受性以及对氧化胁迫的耐受性, 番茄的耐盐性和耐旱性明显增强 (Yang et al., 2015) 。

　　2.2 番茄抗旱性常规育种的研究进展

　　番茄抗旱性的常规育种主要采用大规模回交策略获得集亲本优良性状于一体的新品种, 获得超越亲本的杂交后代或者由基因互作产生亲本不具备的新性状类型, 开发具有改良抗旱性和具有高产潜力的新品种 (Slabbert et al., 2004) 。许多研究表明, 野生番茄及其近缘野生种中含有丰富的耐旱基因, 将这些携带优良耐旱基因的野生番茄与普通栽培种番茄杂交, 可以将双亲的优良性状整合到一起, 从而育成耐旱性强的番茄材料或新品种。例如耐旱野生番茄S.pennellii和普通栽培种番茄S.lycopersicum cv.M82进行杂交, 杂交后代与M82进行回交, 在干旱条件下后代的产量显着高于亲本 (Gur&Zamir, 2004) 。

　　由于常规育种是通过植株的表型性状来推测抗旱性的基因型, 而抗旱性是由多个小的微效基因座控制, 且遗传多样性, 遗传力低, 抗旱性相关性状的基因型-环境相互作用水平较高, 所以番茄抗旱育种中常规育种的进展仍然相当缓慢。随着现代生物技术的迅速发展, 人们开始利用分子生物学手段进行植物抗旱性分子改良研究。在利用基因工程改良番茄抗旱性的同时, 分子标记辅助选择 (MAS) 技术也应用到改良作物抗旱育种实践中。采用MAS技术能够追踪调控抗旱性状的遗传位点, 免去多年的大量田间测试工作, 提高选择效率, 同时高分辨率的遗传图谱和物理图谱建成之后, 就可以通过图位克隆技术分离抗旱相关基因, 研究抗旱基因的功能。同样, 标记辅助回交 (MABC) 的策略可以将抗旱供体基因型的主要数量性状基因座 (QTL) 渗入高产但不抗旱或干旱敏感的受体亲本中, 以提高植物的抗旱性。

　　3 展望

　　番茄营养丰富, 风味独特, 深受人们的喜爱。近年来我国番茄栽培面积不断增加, 尤其是设施栽培。但是农业水资源匮乏是限制番茄生产的重要因素之一, 因此, 科学合理地进行番茄生产是众多研究人员的目标。

　　在自然条件下, 干旱胁迫的时节、强度和持续时间是高度动态和不可预测的, 这使得抗旱性研究复杂化。因此, 如果条件允许, 在评估抗旱时应与其他主要的非生物胁迫如高温和高盐联系起来, 因为干旱胁迫经常伴随高温胁迫的发生, 并且植物在响应这些胁迫时会在多种水平上发生交互作用。

　　通过转基因的方法已经分离和鉴定了许多与作物抗旱性相关的基因。然而, 检测这些基因对番茄抗旱性的影响主要在温室、小盆中或仅在幼苗期间进行, 只有少数在田间检测。由于田间干旱胁迫的复杂性, 那些温室中对改良抗旱性有效的基因在用于育种程序之前必须在田间进行进一步评估。并且一些基因对作物正常生长或增产潜力会有负面影响, 例如植物在遭遇不利的环境时, 植株变得矮小, 减少能量或水分的流失以适应逆境。所以在番茄抗旱育种过程中, 在明确基因功能的基础上, 还需要建立科学的抗旱评价体系。目前, 利用现代分子生物学和MAS结合的方法进行育种, 是提高番茄抗旱性的有效途径。

　　基因组编辑也是一种精准、高效的基因工程方法。其中CRISPR/Cas (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein) 系统只需合成1个sg RNA就能实现对基因的特异性修饰, 操作简单。利用此系统将番茄的Sl MAPK3基因进行定点敲除, 番茄表现对干旱高度敏感 (Wang et al., 2017) 。尽管关于基因编辑技术在番茄抗旱性方面的报道并不多, 但番茄具有高效的转化方法、二倍体基因组、高质量的基因组序列以及极高的经济价值, 在众多双子叶植物中是CRISPR/Cas9基因编辑技术的理想候选者 (Brooks et al., 2014) , 并且基因编辑技术能够定向修饰基因, 能够获得不含转基因痕迹的后代, 操作方便。因此基因编辑技术在改良番茄性状、提高抗旱性方面极具潜力。

　　参考文献

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